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Karlsruhe Institut für Technologie

Institut für Bio- und Lebensmitteltechnik

Teilinstitut IV: Molekulare Aufarbeitung von Bioprodukten

Fritz-Haber-Weg 2

76131 Karlsruhe

Tel: +49 721 608 42557
Fax: +49 721 608 46240

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Experimentelle Prozessentwicklung

 HTPD

Die biopharmazeutische Produktion basiert auf einer Vielzahl komplexer Prozesse mit hohem experimentellem Aufwand. Um den Regularien der Behörden (EMA, FDA, usw.) gerecht zu werden ist ein hohes Maß an Prozessverständnis und Optimierung erforderlich. Im Bereich der experimentellen Prozessentwicklung sind insbesondere Hochdurchsatzmethoden ein immer stärker werdendes Forschungsgebiet. Durch High-throughput Systeme (HTS) unter Verwendung von Pipettierrobotern können Entwicklungszeiten und Arbeitskosten durch Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung stark reduziert werden. Am Lehrstuhl werden HTS Methoden im Bereich der Produktbildung und mikrobiellen Zellkultivierung (Upstream Processing) als auch im Bereich der Aufarbeitung (Downstream Processing) verwendet. Beispiele für roboterbasierte Aufreinigungsverfahren beinhalten Präzipitationsscreenings, Charakterisierung wässriger Zweiphasensysteme sowie Chromatographie im Batch und Säulen Betrieb.


Hochdurchsatz Kultivierung

 BioLector

Die Entwicklung eines idealen biopharmazeutischen Kultivierungs- und Produktbildungsprozesses hängt von einer Vielzahl von Variablen ab. Das Expressionsstamm, der Vektor, das Zielgen sowie die Kultivierungsbedingungen müssen bewertet und ausgewählt werden um die Gesamtproduktausbeute zu maximieren. Beispielsweise kann die Kultivierungstemperatur, der Sauerstoffeintrag oder die Induktionsstrategie entscheidend sein, ob ein Produkt überhaupt gebildet wird, oder ob es in löslicher oder unlöslicher Form vorliegt. Um Kultivierungen optimal hinsichtlich Produktbildung auszulegen ist es wichtig eine Vielzahl paralleler Experimente durchführen zu können. Hierzu eignen Hochdurchsatzkultivierungssysteme wie das am Institut verwendete BioLector System von m2p-Labs, welches von uns für Bakterien und Hefen zur Anwendung kommt. Der BioLector ermöglicht Kultivierungen im 48-Well Maßstab mit Kulturvolumina im µL Maßstab. Optimierte Kultivierungen mit E. coli führten bis zu 50% Produktausbeute bezogen auf die gesamte lösliche Proteinfraktion.

 

 

 

Referenzen

P. Baumann, T. Hahn, J. Hubbuch, High-throughput Micro-scale Cultivations and Chromatography Modeling: Powerful Tools for Integrated Process Development, Biotechnol. Bioeng. (2015), DOI: 10.1002/bit.25630.

C. Ladd Effio, P. Baumann, P. Vormittag, C. Weigel, A. Middelberg, J. Hubbuch, Establishment of a High-throughput Platform for the Production of Virus-like Particles in E. coli, J. Biotechnol. (2015), DOI: 10.1016/j.jbiotec.2015.12.018.

P. Baumann, N. Bluthardt, S. Renner, H. Burghardt, A. Osberghaus, J. Hubbuch, Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag for real-time tracking of stability and solubility of proteins, J. Biotechnol. (2015), DOI: 10.1016/j.jbiotec.2015.02.024.


Wässrige Zweiphasensysteme

ATPS

Wässrige 2-Phasensysteme (ATPS) können zur besonders schonenden Aufreinigung von Biomolekülen und Zellen eingesetzt werden. Leichte Skalierbarkeit, niedrige Kosten und die Integration von Aufkonzentrierung und Aufreinigung des Zielprodukts in einem Prozessschritt zeichnen 2-Phasensysteme gegenüber chromatographischen Trennprozessen aus. Zur Prozessentwicklung müssen Systeme aus phasenbildenden Komponenten näher charakterisiert werden. Auf einer Roboterplattform können im miniaturisierten Maßstab Phasendiagramme aufgenommen, Phasenvolumina bestimmt und die Verteilung von Biomolekülen in Unter- und Oberphase bestimmt werden. Da die Optimierung eine rein empirische Aufgabe mit zahlreichen Parametern darstellt, wird ein genetischer Algorithmus zur Optimierung verwendet. Am Institut konnte in einer Studie mit Avidin aus Hühnereiweis eine Aufreinigung um den Faktor 5,9 bei einer Avindinausbeute von 92% erreicht werden. Dabei wurde das PEG / Phosphat ATPS mit Hilfe von robotergestützen Hochdurchsatzmethoden optimiert.

 

Referenzen

S. A. Oelmeier, F. Dismer, J. Hubbuch, Application of an aqueous two-phase systems high-throughput screening method to evaluate mAb HCP separation, Biotechnology and Bioengineering (2010), DOI: 10.1002/bit.22900.

P. Diederich, S. Amrhein, F. Hämmerling, J. Hubbuch, Evaluation of PEG/phosphate aqueous two-phase systems for the purification of the chicken egg white protein avidin by using high-throughput techniques, Chemical Engineering Science (2013), DOI: 10.1016/j.ces.2013.10.008.

C. Ladd Effio, L. Wenger, O. Ötes, S. A. Oelmeier, R. Kneusel, J. Hubbuch, Downstream processing of virus-like particles: Single-stage and multi-stage aqueous two-phase extraction, Journal of Chromatography A (2015), DOI: 10.1016/j.chroma.2015.01.007.


Proteinpräzipitation

Loeslichkeit

Präzipitation von Biomolekülen stellt eine Alternative zu herkömmlichen säulenbasierten Prozessen in der biopharmazeutischen Aufarbeitung dar. Die präparative Präzipitation ist ein einfacher, kostengünstiger und leicht zu skalierender Prozessschritt. Sie kann sowohl am Anfang eines Bioprozesses als Capture Schritt oder auch gegen Ende zum polishing oder zur Aufkonzentrierung des Zielproduktes eingesetzt werden. Bei der Prozessentwicklung können eine Vielzahl von Präzipitaionsbedingungen, wie Präzipitantenart, Präzipitantenkonzentration aber auch die Präzipitationskinetik untersucht und optimiert werden. Für die Ausbeute und Reinheit spielt zudem die optimale Rücklösung des ausgefällten Zielproteins eine Entscheidende Rolle. Am Institut werden diese verschiedenen Prozessparamter, für Proteine wie z.B. Antikörper, Virus Like Partikels oder inaktivierte Viren mit Hilfe von robotergestützte Hochdurchsatzexperimente in 96 Well Mikrotiterplatten durchgeführt. Für Antikörper konnte dabei eine Reduzierung des HCP Gehalts um bis zu 93% bei gleichzeitiger 96% Rückgewinnung des Zielprodukts erreicht werden.